Bahan-bahan Pembuatan Polyacrylamide Gel Electrophoresis

Berdasarkan Wikipedia (2018), PAGE (Polyacrylamide Gel Electrophoresis) adalah teknik pemisahan protein atau nucleic acids (yang lebih kita kenal dengan DNA atau RNA) ke molekul-molekul pembentuknya menggunakan gel.

Pemisahan ini dapat sesuai karakteristik ukuran, berat, bentuk atau muatan molekul-molekul protein atau nucleic acids tersebut. Contohnya berdasarkan ukuran molekul, karena luas penampangnya semakin besar, maka semakin besar pula hambatan molekul untuk bergerak dalam gel.

Penjelasan tentang proses electrophoresis ini sendiri, akan dijelaskan pada tulisan selanjutnya.

Berikut ini adalah nama bahan-bahan dan berikut fungsinya dalam pembuatan gel, yang penulis himpun untuk mengetahui pengaruh volume terhadap bahan terhadap campuran resep gel, sebagai referensi pembuatan simulator praktikum polyakrilamide:

Acrylamide

Berupa larutan yang digunakan sebagai salah satu bahan utama pembuatan gel.

Dalam praktikum ini, bahan praktikum menggunakan larutan acrylamide dengan konsentrasi 30%. Di mana sebenarnya di pasar dijual juga larutan acrylamide dengan beda konsentrasi, bahkan ada yang dijual dalam bentuk bubuk. Sehingga dalam praktikum sesungguhnya di laboratorium, praktikan dapat menyesuaikan jumlah konsentrasi yang dibutuhkan, sesuai konsentrasi acrylamide yang tersedia.

Bio-Rad: 30% Acrylamide/Bis Solution

Sedangkan untuk implementasi dalam praktikum, perhitungan volume acrylamide yang akan ditambahkan, dapat mengikuti contoh dibawah ini.

Dimisalkan acrylamide yang akan digunakan sebagai bahan pembuatan resolving gel dengan nilai 10% acrylamide. Hal ini berarti yang dibutuhkan acrylamid dengan konsentrasi 10% dari volume total resep gel. Jika volume total resep gel adalah 10 mL, maka jumlah acrylamide yang ditambahkan dalam resep adalah:

Vol=10%*10mL/30%

      =3.3mL

Contoh lain, untuk pembuatan stacking gelnya, jika dibutuhkan 5% acrylamide untuk 10mL total volume resep gel, maka volume 30% acrylamide yang perlu ditambahkan adalah:

Vol=5%*10mL/30%

      =1.67mL

Dan inilah jawaban misteri angka 10% acrylamide dan 5% acrylamide pada resolving dan stacking gel pada posting sebelumnya.

TBE

TBE (microbiology.ucdavis.edu, 2018) adalah buffer yang diperlukan dalam gel untuk mencegah denaturasi (perubahan sifat) bagian kecil DNA yang sudah terpecah akibat terkena panas. Dalam praktikum, TBE yang digunakan bernilai 0.5x atau 1x.

Thomassci.com
Dalam electrophoresis dapat juga digunakan TAE (Tris-Acetic Acid-EDTA), namun untuk electrophoresis yang dijalankan lebih dari 8 jam, lebih baik menggunakan TBE, karena TAE tidak memberikan kapasitas buffering sebanyak TBE dan mempunyai karakteristik yang lebih lambat. Namun hal ini juga tergantung pada orientasi pemisahan ke arah parameter acuan.


SDS

Sodium Dodecyl Sulfate, CH3(CH2)11SO4 Na, adalah larutan yang digunakan pada proses elctrophoresis yang berorientasi pada massa. Sehingga alat electrophoresis yang digunakan harus yang memiliki posisi pergerakan arah running vertikal.

Sodium Dodecyl Sulfate #1610301
Sesuai kegunaannya, SDS sebenarnya berfungsi untuk melarutkan protein dan meng-generate muatan negative. Namun berdasarkan praktikum yang dilakukan oleh narasumber, karena simulator dibuat untuk klasifikasi DNA, SDS tidak digunakan dalam simulator ini. Alasannya karena DNA telah memiliki muatan sendiri, sehingga tidak perlu digenerate menggunakan SDS.

Semoga tidak diikutkannya SDS ini bukan karena alasan pengiritan bahan-bahan praktikum yang memang mahal oleh pihak lab.

dH2O

Air hasil destilasi. Penambahan bahan ini dimaksudkan agar terjadi hidrolisis, atau bisa disebut juga pengenceran. Hidrolisis ini memicu ion-ion molekul sampel untuk terlepas dari ikatannya.

Penggunaan kata hidrolisis disini, masih diragunakan ketepatannya oleh penulis, untuk menjelaskan kegunaan bahan dH2O ini.

Ammonium Persulphate

Ammonium Persulphate (NH4)2S2O digunakan sebagai katalis kopolimerisasi gel acrylamide. Atau dapat dikatakan juga sebagai bahan yang berfungsi menggenerasi radikal bebas. Radikal bebas yang dihasilkan dari reaksi reduksi-oksida inilah yang menjadi penyebab terjadinya reaksi polimerisasi.

Menurut sepemahan penulis, polimerisasi yang terjadi disini adalah agar gel menjadi keras/menggumpal. Sehingga dalam praktikum, penambahan bahan ini tidak boleh terlalu dini.

TEMED

Katalis tambahan kopolimerisasi gel acrylamide selain Ammonium Persulphate.

Dugaan sementara, TEMED dan Ammonium Persulphate adalah bahan yang menyebabkan bentuk gel berubah seperti plastik di akhir praktikum.

Keterangan mengenai bahan dan fungsinya di atas masih akan dapat berubah seiring bertambahnya pengetahuan penulis di masa datang, ketika ditemukan pengertian dan kegunaan bahan-bahan electrophoresis yang baru.

Dari sini, menurut penulis nama yang paling sesuai untuk simulator adalah dengan nama Simulator Praktikum PAGE.

Referensi



Comments

Post a Comment

Catatan

Seluruh konten yang berada dalam blog ini, karena penulis juga masih belajar, konten dapat diubah sewaktu-waktu baik atau tanpa pemberitahuan sebelumnya.

Popular posts from this blog

Apa itu Acrylamide

Image
Pengetahuan tentang dasar Acylamide sangat diperlukan dalam tahap pembuatan simulator Polyacrylamide ini. Saat tulisan ini ditulis, sebenarnya penulis belum mengerti sepenuhnya dengan arah pembuatan simulator. Apakah nama judul praktikum yang dimaksudkan adalah polyacrylamide, acrylamide saja atau dengan nama yang lain. Oleh karena itu, tulisan ini adalah sebagian keingin-tahuan penulis tenang tujuan diadakannya praktikum polyacrylamide.  Dari foodstandards.gov.au dikatakan bahwa Acrylamide adalah zat kimia yang terbentuk pada makanan bertepung secara alami, ketika makanan tersebut dimasak. Meskipun acrylamide tidak ditemukan bukti dapat menyebabkan kanker pada manusia, namun terdapat bukti bahwa zat ini dapat menyebabkan kanker pada hewan laboratorium. Bukti lebih lanjut dapat dibaca di sini . Sedangkan menurut Andrew Don (2017) , salah satu tanda yang paling mudah, bahwa suatu makanan memiliki kandungan acrylamide adalah perubahan warna yang coklat dan perbedaan rasa. Semaki...
Read more

Visualisasi Perbandingan Volume Bahan Gel Polyacrylamide

Image
Berikut ini adalah visualisasi perbandingan volume dalam resep pembuatan resolving gel dan stacking gel untuk praktikum Polyacrylamide: Resolving Gel 30% Acrylamide 3.3 mL 1.5M Tris, pH 8.8 2.5 mL SDS 0.1 mL dH 2 O 4.0 mL Ammonium Persulphate 0.1 mL TEMED 0.004 mL Stacking Gel 30% Acrylamide 1.65 mL 0.5M Tris, pH 6.8 2.5 mL SDS 0.1 mL dH 2 O 5.65 mL Ammonium Persulphate 0.1 mL TEMED 0.004 mL Dari kedua gambar di atas terlihat bahwa, yang membedakan hanyalah volume Acrylamide dan air destilasi. Dimana untuk stacking gel lebih banyak mengandung air (lebih encer), dikarenakan memang stacking gel adalah tempat penempatan sampel dan sebagai titik awal proses electrophoresis.
Read more